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O Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) é uma das doenças infecciosas mais sérias que tem afetado a humanidade, cujo agente causador é o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Em geral, o sistema imunitário fica enfraquecido, levando a um aumento da suscetibilidade dos pacientes a infeções de baixa gravidade na ausência da imunossupressão, bem como tumores que normalmente não afetam indivíduos saudáveis. Existem dois tipos de HIV, sendo o vírus do tipo 1 (HIV-1) o mais virulento e o responsável pela presente pandemia. Segundo o último relatório do Programa para a SIDA das Nações Unidas (UNAIDS), em 2011, 34 milhões de pessoas estavam infetadas com HIV e cerca de 1,7 milhões de pessoas morreram com SIDA. O HIV originou-se a partir de múltiplas transmissões zoonóticas do vírus da imunodeficiência símia (SIV) proveniente de primatas não-humanos para seres humanos, na África Ocidental e Central. Devido à elevada variabilidade genética que o HIV possui, existem atualmente vários subtipos e várias formas recombinantes que são responsáveis pela transmissão do vírus entre humanos. O HIV-1 é um retrovírus constituído por um envelope lipídico derivado da membrana plasmática da célula hospedeira. Em termos de composição da membrana viral, esta possui proteínas envolvidas no processo de entrada do vírus na célula alvo. O complexo glicoproteico gp120-gp41 é o responsável pela iniciação do processo de infeção da célula hospedeira. Mais especificamente, a gp120 tem como função a ligação do virião à célula alvo (maioritariamente linfócitos T) via recetor CD4, enquanto a gp41 é a subunidade proteica responsável pelo processo de fusão entre a membrana viral e a membrana da célula hospedeira. A inibição da replicação do vírus por uso dos agentes antirretrovirais clássicos, cujo alvo são 3 enzimas do ciclo replicativo (transcriptase reversa, integrase e protease), tem levado à geração de estirpes de vírus resistentes aos fármacos. Para além disso, estes antirretrovirais apenas atuam após o genoma viral ter entrado na célula. De modo a ultrapassar estes problemas, foram desenvolvidas moléculas que têm como função inibir o processo de entrada do vírus na célula alvo, mais especificamente, o processo de fusão membranar mediado pela proteína gp41. Estas moléculas são designadas por inibidores de fusão (FIs), existindo atualmente várias classes consoante o seu alvo molecular. Visto que as proteínas necessárias ao processo de fusão estão em contacto com membranas, a eficácia dos FIs também está relacionada com a afinidade destes para com as membranas. Este facto reitera a importância das membranas como fator essencial para um possível aumento da concentração local dos FIs junto do seu alvo molecular. Nesta dissertação foram estudados vários inibidores de fusão do HIV-1, com o objetivo de avaliar a interação dos mesmos com sistemas modelo de biomembranas e igualmente com as membranas de algumas células do sangue, nomeadamente linfócitos e eritrócitos. Os inibidores de fusão estudados são de origem peptídica e foram desenhados a partir da região CHR da proteína gp41, que está envolvida no processo de fusão membranar. Todos os péptidos derivados dessa região são designados por péptidos C ou por inibidores de fusão classe I, tendo como alvo molecular a região NHR da proteína gp41. Portanto, o que estes inibidores fazem é mimetizarem a região CHR e intrometerem-se na ligação destas duas regiões (CHR-NHR) e impedirem que ocorra a fusão entre o vírus e a célula alvo. O péptido inibidor de fusão que está na base dos estudos aqui apresentados é o C34. Possui 34 resíduos de aminoácidos, e apresenta atividade antiviral. No terminal amina deste péptido está presente o pocket-binding domain (PBD), importante para a ligação à região NHR, mas o terminal carboxilo não possui o lipid-binding domain (LBD) que muitos outros C péptidos possuem para conseguirem interagir com membranas. Apesar de não possuir o LBD, este péptido possui uma alta atividade antiviral, e tem sido usado como modelo para a geração de novos inibidores de fusão. A conjugação de um domínio de colesterol ao terminal carboxilo do péptido C34 levou a um aumento considerável da atividade antiviral por parte do novo inibidor de fusão, C34-colesterol. Combinando dimerização, colesterol e adição de unidades de polietilenoglicol (PEG) originaram-se mais dois novos derivados do C34. Um dos derivados de péptidos é muito semelhante ao C34-colesterol, onde apenas foi adicionado um espaçador de polietilenoglicol (PEG) entre o colesterol e o péptido, dando origem ao HIVP3 (C34-PEG4-colesterol). O outro inibidor é um dímero deste último composto, [C34-PEG4]2-colesterol, e designa-se HIVP4. Tanto o HIVP3 como o HIVP4 apresentam uma atividade antiviral melhorada relativamente ao C34-colesterol, para além de um elevado tempo de semivida em circulação. Como controlo foi desenhado o péptido HIVP5, [C34-PEG11]2, um análogo do HIVP4, mas sem o domínio de colesterol. Recorrendo a lipossomas marcados com uma sonda fluorescente sensível ao potencial de dipolo da membrana, di-8-ANEPPS, concluiu-se que o C34-colesterol apresenta uma maior interação com membranas que contêm uma elevada percentagem de colesterol. Quanto ao péptido não conjugado, C34, este não tem tendência para interatuar com membranas. Estes resultados foram incluídos num artigo publicado na revista PLoS One (doi:10.1371/journal.pone.0060302). Relativamente aos compostos HIVP3, HIVP4 e HIVP5, o objetivo foi estudar a interação destes compostos com sistemas modelo de biomembranas e com células do sangue humano, nomeadamente linfócitos e eritrócitos. Devido à presença de resíduos de triptofano na sequência de aminoácidos destes péptidos, foi possível estudar a sua partição com vesículas lipídicas (lipossomas) de composição variável. Através da excitação seletiva dos resíduos de triptofano, e deteção da emissão de fluorescência dos mesmos, concluiu-se que tanto o HIVP3 como o HIVP4 particionam preferencialmente para vesículas lipídicas ricas em colesterol. Por outro lado, o controlo HIVP5 não particiona para membranas, tal como no caso do C34. Por comparação dos valores da constante de partição dos novos péptidos com os do C34-colesterol, propusemos que a presença de PEG pode estar a influenciar a menor inserção dos resíduos de triptofano na membrana observada para o HIVP3 e HIVP4. De seguida, medindo as alterações na pressão superficial que os compostos induzem numa monocamada lipídica, concluiu-se que o HIVP4 tem uma maior afinidade para as monocamadas relativamente ao HIVP3. Para além disso, o HIVP4 apresenta uma cinética de inserção mais rápida que o HIVP3. Com estes resultados, concluímos que a dimerização presente no HIVP4 influencia a cinética e a afinidade do péptido para estes sistemas lipídicos. Quanto à localização dos péptidos na bicamada lipídica, recorrendo a experiências de extinção de fluorescência em solução aquosa e em membrana, concluímos que tanto o HIVP3 como o HIVP4 apresentam os seus resíduos de triptofano muito expostos ao ambiente aquoso, o que nos permite concluir e explicar os baixos valores de partição e a menor afinidade para membranas. Apesar de os péptidos interagirem menos com as membranas através dos seus resíduos de triptofano, a presença de colesterol poderá permitir ao inibidor de fusão uma interação forte com a membrana através deste domínio. Com recurso a lipossomas marcados com uma sonda fluorescente sensível ao potencial de dipolo, di-8-ANEPPS, concluímos que os compostos HIVP3 e HIVP4 interagem preferencialmente com membranas com alto conteúdo em colesterol. Mais especificamente, a maior interação foi observada para a composição lipídica que mimetiza as jangadas lipídicas, onde se sabe que estão presentes os recetores envolvidos na fusão viral. Em relação à interação com linfócitos e eritrócitos, usando a marcação das membranas com di8-ANEPPs, concluímos que o HIVP4 interage mais com linfócitos do que o HIVP3. Quanto aos eritrócitos, ambos os péptidos apresentam uma interação semelhante. Em resumo, tanto o HIVP3 como HIVP4 apresentam uma menor partição, afinidade e uma localização mais superficial na bicamada lipídica comparativamente ao C34-colesterol. A presença de um espaçador de PEG e a dimerização são determinantes para explicar os resultados observados. O espaçador permite um maior afastamento entre o domínio de colesterol e o péptido, o que pode explicar a menor interação com as membranas observada ao nível dos resíduos de triptofano. Por outro lado, a dimerização pode ser fundamental ao influenciar a concentração do péptido ao nível da membrana. A presença do domínio de colesterol é necessária para a interação dos péptidos com a membrana, especialmente em composições lipídicas ricas em colesterol. Viral fusion inhibitors are designed to block the fusion between the membranes of an enveloped virus and a target cell, therefore preventing the entrance of the viral content. Recently, the conjugation of cholesterol to a HIV-1 fusion inhibitor peptide, C34, resulted in an increase of the antiviral potency of the conjugated peptide (C34–cholesterol). Moreover, the combination of cholesterol-tagging, using a PEG moiety as spacer, and dimerization of the C34 peptide sequence, improved the antiviral potency and extended the in vivo half-life of two new HIV fusion inhibitors: HIVP3 (C34–PEG4–cholesterol) and HIVP4 ([C34–PEG4]2–cholesterol). The aim of the present work was to evaluate the interaction of these molecules with membrane model systems and human blood cells, in order to clarify their mechanism of action at the molecular level. The first tagged-generation peptide, C34-cholesterol, interacts preferential with cholesterol-rich membranes, while C34 alone does not. The new generation of tagged peptides, HIVP3 and HIVP4, has also a preference for cholesterol-rich liquid ordered membranes, especially membranes that mimic biological microdomains known as lipid rafts. Regarding the human erythrocytes and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), HIVP3 and HIVP4 are able to interact with both blood cells to a similar degree as C34–cholesterol. However, the pocket binding domain (PBD) on HIVP3 and HIVP4 is more exposed to the aqueous environment than on C34–cholesterol. The present data indicate that the more efficient blocking of HIV entry results from the synergic effect between the membranotropic behavior promoted by the cholesterol moiety and the enhanced exposure of the PBD associated to the PEG spacer. Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013

The dynamics of turbulence generated and controlled by polymer additives is investigated from the perspective of the coupling between polymer dynamics and flow structures. Direct numerical simulations of channel flow with Reynolds numbers ranging from 1,000 to 10,000 (based on the bulk and the channel height) are used to study the formation and dynamics of elastic instabilities and their effects on the flow. The resulting mechanism of interactions between polymer dynamics and the flow helps resolve a long-standing controversy in the understanding of polymer drag reduction and explains the phenomenon of early turbulence, or onset of turbulence at lower Reynolds numbers than for Newtonian flows, previously observed in polymeric flows.

This package contains the codes and scripts accompanying the manuscript "Protein-coding repeat polymorphisms strongly shape diverse human phenotypes" by Ronen E. Mukamel, Robert E. Hansaker, Maxwell A. Sherman, Alison R. Barton, Yiming Zheng, Steven A. McCarroll, and Po-Ru Loh.

O nucleossoma é a subunidade fundamental da cromatina eucariótica. As histonas, proteínas características do nucleossoma, são pequenas proteínas básicas subdivididas em duas superfamílias: linker (H1) e core (H2A, H2B, H3 e H4). As histonas core oligomerizam para formar o octamero de histonas que, conjuntamente com ADN de cadeia dupla, estabelecem a estrutura complexa do nucleossoma. A estrutura do nucleossoma foi inicialmente identificada em 1975 recorrendo à digestão da cromatina por uma nuclease micrococal, sendo que apenas em 1997 foi divulgada a estrutura do nucleossoma obtida por difração de raios-X com uma resolução de 2.8 Å, e mais tarde, em 2002, com uma resolução de 1.9 Å, o que revela ser mais do que suficiente para as cadeias laterais e a cadeia principal serem observadas com elevado grau de confiança. As histonas partilham um domínio entre elas: o histone fold, constituído por cerca de 70 resíduos de aminoácidos, capaz de facilitar a heterodimerização das histonas e que se encontra localizado na região C-terminal e consiste em três hélices-α (α1, α2 e α3) ligadas entre si por dois loops (L1 e L2) flanqueando a hélice-α 2. As histonas são constituídas por um domínio globular e uma região N-terminal flexível rica em resíduos de lisina e arginina. Estas proteínas heterodimerizam com o auxílio de interações hidrofóbicas, formando o handshake motif. No contexto celular, o nucleossoma permite o empacotamento do genoma no espaço relativamente limitado disponível dentro do núcleo, através do folding numa série de estruturas moleculares de ordem gradualmente superior. Mais ainda, permite a regulação temporal e espacial de vários processos modelados pelo ADN, como por exemplo a transcrição, a replicação e o reparo de ADN, necessários para que as células prosperem e exerçam as suas funções. Desde a sua descoberta na década de 1960, as modificações pós-tradicionais de histonas (e.g. metilação, fosforilação e acetilação) foram associadas à regulação da expressão génica, com algumas modificações sendo associadas à ativação de genes, enquanto outras foram associadas ao seu silenciamento. Vários estudos demonstraram a existência de um “código de histonas” que estipula que diferentes modificações pós-tradicionais nas histonas afetam as afinidades de ligação de proteínas capazes de estabelecerem uma ligação à cromatina, levando a estados transcricionais alterados do ADN subjacente. A informação epigenética codificada por estas modificações que ocorrem nas histonas pode ser passada para a próxima geração de células, agindo como uma camada adicional de informação que pode ser armazenada dentro da célula, aumentando ainda mais a complexidade e a variabilidade do material genético. Foi previamente demonstrado que o nucleossoma exibe um deslocamento, quando incubado a altas temperaturas, para os terminais da molécula de ADN que está enrolada em volta do nucleossoma. Neste contexto, o presente projeto visa observar a influência da distorção do octamero de histonas na mobilidade térmica do nucleossoma. Deste modo, vários mutantes de histonas foram preparados, embora apenas um nucleossoma mutante tenha sido gerado, além do nucleossoma wild-type. Para a obtenção de histonas recombinantes com elevado grau de pureza, recorreu-se a técnicas cromatográficas. Em primeiro lugar, foram expressas histonas recombinantes (wild-type e mutantes) em células Escherichia coli BL21 (DE3) Rosetta competentes a partir de plasmídeos in house. As histonas core H2A e H2B, bem como H3 e H4, foram coexpressas, uma vez que a coexpressão destes dois pares de proteínas reduz o tempo necessário para a sua síntese, para além de produzir complexos solúveis passíveis de serem purificados por sucessivas técnicas experimentais. Posteriormente, executou-se a purificação das mesmas através do uso de uma cromatografia de afinidade seguida duma cromatografia de troca iónica. Após todas as histonas terem sido geradas em grandes quantidades e elevado grau de pureza, efetuou-se a montagem do octamero. Paralelamente, foi sintetizada a sequência Widom 601, previamente descrita na literatura como sendo uma sequência de muito alta afinidade para o nucleossoma, via PCR usando primers apropriados. Neste trabalho foram geradas duas variantes da sequência supramencionada: curta (147 pb) e longa (227 pb). Uma vez obtidos todos os componentes necessários para a montagem do nucleossoma, recorreu-se à reconstituição do mesmo através de diálises (com gradiente de salinidade). Por fim, os nucleossomas gerados foram usados para serem efetuados thermal shift assays e native gel shift assays. Os thermal shift assays foram usados para se observar o deslocamento do nucleossoma ao longo do ADN (baseado na sequência Widom 601) e o efeito da distorção do octamero na mobilidade do nucleossoma induzida pela temperatura. Quanto aos native gel shift assays, um ensaio experimental rápido e sensível para a deteção de interações proteína-ácido nucleico, foram usados para observar a afinidade de ligação de diversas proteínas com ligação putativa à cromatina. Este trabalho corroborou o padrão observado de deslocamento de nucleossomas wild-type para as extremidades do ADN associado ao mesmo. O nucleossoma mutante H4_V43C H3_F104C concebido neste projeto demonstrou estar associado ao aumento da integridade estrutural e rigidez do nucleossoma, possivelmente através do estabelecimento de uma ponte dissulfeto entre L1 (loop 1) da histona H4 e 2 (hélice- 2) da histona H3. O estudo do impacto da plasticidade do octamero de histonas, consequência das diversas modificações que podem ocorrer nos seus resíduos de aminoácidos e que levam à distorção do core de histonas, é relevante no sentido de tentar entender o seu papel na regulação da expressão génica. Uma dada mutação irá, hipoteticamente, reforçar a estrutura do nucleossoma, potencialmente impossibilitando o acesso do complexo basal de transcrição, devido à alteração da capacidade de mobilidade do nucleossoma em relação ao ADN, e silenciando o(s) gene(s) codificados no ADN subjacente que se encontra “blindado” pelo nucleossoma, e vice-versa. Também será possível que alguns complexos capazes de remodelar a cromatina possam tirar partido da alteração da integridade estrutural conferida pelas diversas mutações ou pela presença de variantes de histonas. Numa visão geral, os resultados obtidos neste projeto demonstraram que é necessária uma certa plasticidade do octamero de histonas para se observar o movimento não-catalisado do nucleossoma. Adicionalmente, foi tentada a análise da Fkbp39, uma peptidilprolil isomerase com um domínio NPL (nucleoplasmin-like) conservado na região N-terminal, que se pensa ser uma chaperona de histonas em S. pombe e que é responsável pelo aumento da taxa de isomerização cis-trans das prolinas na cauda N-terminal (região N-terminal flexível) da histona H3. A análise foi feita por criomicroscopia eletrónica, tanto com a Fkbp39 não-complexada, como em complexo com (H2A-H2B) e com (H3-H4)2. Nesse sentido, expressou-se a proteína Fkbp39 em células E. coli BL21 (DE3) Rosetta competentes e foi executada a sua purificação com elevado grau de pureza através do uso de diferentes técnicas cromatográficas (cromatografias de afinidade, de troca iónica, e de exclusão molecular). Embora as purificações tenham sido bem-sucedidas, nem a proteína Fkbp39 isolada, nem em complexo com o dímero (H2A-H2B) ou com o tetramero (H3-H4)2 foram passíveis de serem observadas por criomicroscopia electrónica. É possível que, devido à presença de uma região central dinâmica intrinsecamente desordenada, estratégias sucessivas de otimização sejam necessárias para estabilizar os complexos putativos. Por último, várias proteínas putativas de ligação à cromatina foram rastreadas quanto à ligação aos nucleossomas sintetizados neste projeto recorrendo a native gel shift assays. Hpf1 (Histone PARylation factor 1), Parp2 (Poly [ADP-ribose] polymerase 2) e Alf (TFIIA-alpha and beta-like factor), provenientes de Homo sapiens, demonstraram ser os melhores candidatos para estudos estruturais posteriores mais aprofundados para averiguar com maior confiança as suas afinidades de ligação à cromatina. The nucleosome is the fundamental repeating subunit of eukaryotic chromatin. The histones, hallmarks of the nucleosome, are small basic proteins subdivided into two super families: linker (H1) and core histones (H2A, H2B, H3 and H4). Core histones assemble together to form the histone octamer which then, together with double-stranded DNA, embodies the complex structure of the nucleosome. Most importantly, the nucleosome allows for the tight packaging of the large genome into the relatively constricted space available inside the nucleus by folding into a series of higher-order molecular structures. Furthermore, it allows for the fine-tuned temporal and spatial regulation of several DNA-templated processes, such as DNA transcription, replication and repair, unequivocally required for the cells to thrive and exert their functions. Since their discovery in the 1960s, histone post-translational modifications (e.g. methylation, phosphorylation and acetylation) have been shown to affect gene expression regulation, with some modifications being associated with gene activation, whilst others have been associated with gene silencing. Interestingly, several studies have demonstrated the existence of a “histone code” which states that the presence of post-translational modifications on histones affect binding affinities of chromatin-binding proteins leading to altered transcriptional states of the underlying DNA. The epigenetic information encoded via these modifications occurring on histones can be passed on to the next generation of cells, acting as an additional layer of information that can be stored inside the cell, further increasing the complexity and versatility of the genetic material. It has been shown that the nucleosome exhibits shifting when incubated at high temperatures towards the DNA ends in regard to the nucleosomal DNA. In this context, the current project aims to observe the influence of histone octamer core distortion on nucleosome thermal mobility. To do so, several histone mutants were prepared, albeit only one mutant nucleosome was assembled, apart from the wild-type nucleosome. This work corroborates the observed thermally-driven shifting pattern of wild-type nucleosomes. The H4_V43C H3_F104C mutant nucleosome assembled in this project has shown itself to increase nucleosome structural integrity, possibly through the establishment of a disulphide bridge between L1 (loop 1) of core histone H4 and 2 (-helix 2) of core histone H3, conversely, hindering nucleosome mobility. This suggests that for nucleosome to slide along DNA in a noncatalyzed fashion, there must be a requirement of histone octamer plasticity. Moreover, structural analysis of Fkbp39, a putative histone chaperone in Saccharomyces pombe, both alone and in complex with (H2A-H2B) and with (H3-H4)2 was attempted with electron cryomicroscopy, though unsuccessful. Further optimization strategies are likely required to stabilize the putative complexes. Lastly, several chromatin-binding proteins were screened for binding to the nucleosome, as a complementary experiment. Hpf1, Parp2 and Alf from Homo sapiens seem like the best candidates for more in-depth studies to fully disclose their binding affinities to chromatin. Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018

The genetic component of Alzheimer’s disease (AD) has been mainly assessed using Genome Wide Association Studies (GWAS), which do not capture the risk contributed by rare variants. Here, we compared the gene-based burden of rare damaging variants in exome sequencing data from 32,558 individuals —16,036 AD cases and 16,522 controls— in a two-stage analysis. Next to known genes TREM2, SORL1 and ABCA7, we observed a significant association of rare, predicted damaging variants in ATP8B4 and ABCA1 with AD risk, and a suggestive signal in ADAM10. Next to these genes, the rare variant burden in RIN3, CLU, ZCWPW1 and ACE highlighted these genes as potential driver genes in AD-GWAS loci. Rare damaging variants in these genes, and in particular loss-of-function variants, have a large effect on AD-risk, and they are enriched in early onset AD cases. The newly identified AD-associated genes provide additional evidence for a major role for APP-processing, Aβ-aggregation, lipid metabolism and microglial function in AD.

The rapid development of new biomaterials and techniques to modify them challenge our capability to characterize them using conventional methods. In response, numerous high-throughput (HT) strategies are being developed to analyze biomaterials and their interactions with cells using combinatorial approaches. Moreover, these systematic analyses have the power to uncover effects of delivered soluble bioactive molecules on cell responses. In this review, we describe the recent developments in HT approaches that help identify cellular microenvironments affecting cell behaviors and highlight HT screening of biochemical libraries for gene delivery, drug discovery, and toxicological studies. We also discuss HT techniques for the analyses of cell secreted biomolecules and provide perspectives on the future utility of HT approaches in biomedical engineering.

In Small-RNA-mediated pathways, small RNAs engage a protein of the Argonaute family and utilize base-pairing interactions to identify and regulate complementary genetic information. My research has focused on understanding how diverse classes of small RNAs in the model organism Caenorhabditis elegans interact with specific members of the Argonaute protein family to carry out unique biological functions. During RNA interference (RNAi), functionally and structurally distinct Argonaute proteins act sequentially to silence target mRNAs. In the first step, the Argonaute RDE-1 interacts with primary siRNAs, and interaction of this complex with the target mRNA triggers a secondary amplification step. In this second step, RNA dependent RNA polymerases (RdRPs) use the targeted mRNA as a template to generate an abundant pool of small RNAs (22G-RNAs), which interact multiple Argonaute proteins to mediate target silencing. Several endogenous small-RNA-mediated pathways are essential for germline development. One of these pathways is required for chromosome segregation and relies exclusively on the Argonaute CSR-1, which utilizes 22G-RNAs generated from proteincoding genes to promote the proper organization of chromatin domains. A distinct 22GRNA germline pathway utilizes ‘aberrant’ RNAs as templates and is essential in maintaining genome stability. Proper germline development also requires the 21U-RNA class of small RNAs. 21U-RNAs specifically interact with the Piwi Argonaute PRG-1, thus establishing 21URNAs as members of the piRNA family, which is important for germline integrity in all metazoans. With only one known exception, 21U-RNAs fail to exhibit sequence complementarity or evidence for direct regulation of other expressed sequences. We now appreciate that the extent and means of small RNA regulation is much greater than we initially expected. My studies have contributed to the emerging theme that small RNA pathways function on a genome-wide scale, to regulate many aspects of cell biology and organismal homeostasis, from chromosome structure to gene expression. Fundação para a Ciência e Tecnologia (bolsa de referencia SFRH/BD/11803/2003), NIH grant GM58800 e Howard Hughes Medical Institute. Tese de doutoramento, Biologia (Genética), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011